Джъстин Уилман Чеймбърс е роден на 11 юли 1970 г. в Спрингфийлд, щата Охайо, в многодетно семейство – той е един от петима братя и сестри, включително и неговия близнак Джейсън. Родителите му, Памела Сю и Джон Уилям Юджийн Чеймбърс II, са от английски, ирландски и германски произход. Детството му преминава в малък градски ритъм, далеч от света на блясъка, който по-късно ще го направи известен.
Случайността изиграва ключова роля в съдбата му – докато е на почивка в Париж, Чеймбърс е забелязан от моден скаут в метрото. Това откритие променя живота му: скоро започва да позира за Calvin Klein, Giorgio Armani и други престижни марки, работейки в Европа, Япония и САЩ. От скромен младеж от Охайо той се превръща в лице на международната модна сцена.
В края на 90-те се установява в Ню Йорк, където решава да смени подиума с актьорската сцена. Завършва четиригодишно обучение в престижното H.B. Studio и започва да се изявява в театъра и телевизията. Първите му роли са в сапунената опера *Another World* и телевизионни филми като *Harvest of Fire* и *Rose Hill*, където партнира на млади звезди като Дженифър Гарнър. През 1998 г. списание *Harper’s Bazaar* го описва като „смес от Джеймс Дийн и Марлон Брандо“ – характеристика, която подчертава неговия спокоен, но магнетичен екранен чар.
Големият му пробив в киното идва с *Liberty Heights* (1999) на Бари Левинсън, последван от приключенския *The Musketeer* (2001) и романтичната комедия *The Wedding Planner* (2001), където си партнира с Дженифър Лопес и Матю Макконъхи. Въпреки обещаващия старт, кариерата му временно забавя ход, докато не се завръща с гръм и трясък през 2005 г. като д-р Алекс Карев в медицинския сериал *Grey’s Anatomy*. Образът му на остроумен, но уязвим хирург се превръща в един от най-обичаните в сериала и му носи световна популярност. За милиони зрители той остава едно от емблематичните лица на болницата „Грей Слоун“.
Извън екрана Джъстин е известен със скромния си и семеен начин на живот. Женен е за Кейша Чеймбърс – бивш агент в модна агенция, с която се запознава по време на моделските си години. Двамата са заедно от 1993 г. и имат пет деца. След години на пътуване между Ню Йорк и Лос Анджелис, семейството се установява на Западното крайбрежие, където актьорът продължава да работи в телевизията и киното, като същевременно се ангажира с благотворителни каузи и подкрепа на младежки инициативи.
Комбинацията от естествен чар, скромност и дълбочина в актьорската му игра превръща Джъстин Чеймбърс в един от онези актьори, които рядко търсят прожекторите, но винаги ги заслужават, когато попаднат под тях.